過(guò)氧化物酶標(biāo)記測(cè)定細(xì)胞凋亡

本實(shí)驗(yàn)用過(guò)氧化物酶標(biāo)記測(cè)定了細(xì)胞凋亡。本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養(yǎng)的或從組織中分離的細(xì)胞凋亡測(cè)定。
實(shí)驗(yàn)原理
脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細(xì)胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端，與dATP形成異多聚體，并可與連接了報(bào)告酶（過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶）的抗地高辛抗體結(jié)合。在適合底物存在下，過(guò)氧化物酶可產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)，特異準(zhǔn)確的定位出正在凋亡的細(xì)胞，因而可在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。
毛地黃植物是地高辛的**來(lái)源。在所有動(dòng)物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結(jié)合的配體，因而非特異性反應(yīng)很低。抗地高辛的特異性抗體與脊椎動(dòng)物甾體**的交叉反應(yīng)不到1％，若此抗體的Fc部分通過(guò)蛋白酶水解的方法除去后，則可完全排除細(xì)胞Fc受體非特異性的吸附作用。
主要試劑
1. 磷酸緩沖液PBS（pH7.4）：磷酸鈉鹽50mM，NaCl200mM。
2. 蛋白酶K（200μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K0.02g；PBS100ml。
3. 含2%H2O2的PBS緩沖液（pH7.4）：H2O22.0ml；PBS緩沖液98.0ml。
4. TdT酶緩沖液（新鮮配）：Trlzma堿3.63g用0.1NHCl調(diào)節(jié)pH至7.2，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸鈉29．96g和氯化鈷0.238g。
5. TdT酶反應(yīng)液：TdT酶32μl；TdT酶緩沖液76μl，混勻，置于冰上備用。
6. 洗滌與終止反應(yīng)緩沖液：氯化鈉17.4g；檸檬酸鈉8.82g；ddH2O1000ml。
7. 0.05％二氨基聯(lián)苯（DAB）溶液：DAB5mg；PBS10ml，pH7.4,臨用前過(guò)濾后，加過(guò)氧化氫至0.02%。
8. 0.5％甲基綠（pH4.0）：甲基綠0.5g；0.1M乙酸鈉100ml。
9. 100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。
10. 過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體（ONCOR）。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 標(biāo)本預(yù)處理：
   1）石蠟包埋的組織切片預(yù)處理：將組織切片置于染色缸中，用二甲苯洗兩次，每次5min。用無(wú)水乙醇洗兩次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室溫水解15min，去除組織蛋白。用蒸餾水洗4次，每次2min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。
   2）冰凍組織切片預(yù)處理：將冰凍組織切片置10％中性甲醛中，于室溫固定10min后，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃處理5min，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。
   3）培養(yǎng)的或從組織分離的細(xì)胞的預(yù)處理：將約5×107個(gè)/ml細(xì)胞于4％中性甲醛室溫中固定10min。在載玻片上滴加50～100μl細(xì)胞懸液并使之干燥。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。
2. 色缸中加入含2％過(guò)氧化氫的PBS，于室溫反應(yīng)5min。用PBS洗兩次，每次5min。
3. 用濾紙小心吸去載玻片上組織周?chē)亩嘤嘁后w，立即在切片上加2滴TdT酶緩沖液，置室溫1～5min。
4. 用濾紙小心吸去切片周?chē)亩嘤嘁后w，立即在切片上滴加54μlTdT酶反應(yīng)液，置濕盒中于37℃反應(yīng)1hr（注意：陰性染色對(duì)照，加不含TdT酶的反應(yīng)液）。
5. 將切片置于染色缸中，加入已預(yù)熱到37℃的洗滌與終止反應(yīng)緩沖液，于37℃保溫30min，每10min將載玻片輕輕提起和放下一次，使液體輕微攪動(dòng)。
6. 組織切片用PBS洗3次，每次5min后，直接在切片上滴加兩滴過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應(yīng)30min。
7. 用PBS洗4次，每次5min。
8. 在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05％DAB溶液，室溫顯色3～6min。
9. 用蒸餾水洗4次，前3次每次1min，*后1次5min。
10. 于室溫用甲基綠進(jìn)行復(fù)染10min。用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提起放下10次，*后1次靜置30s。依同樣方法再用100％正丁醇洗三次。
11. 用二甲苯脫水3次，每次2min，封片、干燥后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
注意事項(xiàng)
一定要設(shè)立陽(yáng)性和陰性細(xì)胞對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照的切片可使用DNaseI部分降解的標(biāo)本，陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)照可使用地塞米松（1μM）處理3-4hr的大、小鼠胸腺細(xì)胞或人外周血**細(xì)胞。陰性對(duì)照不加TdT酶，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。